一    細胞分選方法概述

細胞學(xué)研究中一個很重要的課題就是細胞的分離純化，尤其是需要對某種特定的細胞進行功能研究，如對細胞培養(yǎng)上清液通過ELISA分析檢測細胞因子、細胞共培養(yǎng)檢測細胞功能等，都需要得到高純度的目的細胞。因此，高效地分離所需要的目的細胞是進行細胞功能研究的先決條件。

細胞分選（cell sorting）是指根據(jù)細胞所具有的特性把某種特定的細胞亞群從混合的細胞樣品中分離出來的一種技術(shù)，它是對某一特定細胞進行生化分析和功能分析的前提和基礎(chǔ)。常用的細胞分選方法主要有兩大類：一類是基于細胞物理性質(zhì)的密度梯度離心法（Density gradient centrifugation），另一類是基于免疫識別特性的方法，包括熒光激活細胞分選方法（Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）和磁性激活細胞分選法（Magnetic-activated cell separation，MACS）。

密度梯度離心法是基于不同的細胞群之間存在沉降系數(shù)差異的原理建立起來的，在一定的離心力的作用下，不同種類的細胞會以各自不同的速度沉降，在密度梯度不同的區(qū)域上會形成區(qū)帶。這種方法簡單易行，但此種方法分離所得到的細胞純度較低，且細胞表面的標(biāo)志不明確，特異性較差，目前使用較少。

流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是20世紀60年代后期發(fā)展起來的一種利用流式細胞儀（Flow cytometer）進行快速定量分析細胞亞群的物理化學(xué)特性，根據(jù)這些物理化學(xué)特性精確分選細胞的新技術(shù)，F(xiàn)CM主要包括流式分析和流式分選兩部分。FACS最初于1972年提出，是指熒光驅(qū)動的細胞分選新技術(shù)，即利用分選型流式細胞儀分選標(biāo)記有熒光素偶聯(lián)抗體的細胞樣品，通過熒光系統(tǒng)區(qū)分目的細胞和非目的細胞。流式細胞儀通過接受激光照射后液流內(nèi)細胞的散射光信號和熒光信號反映細胞的物理化學(xué)特性，如細胞的大小、顆粒度以及抗原分子的表達情況等，目前已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究。流式細胞分選被認為是細胞分選的“金標(biāo)準(zhǔn)"，它分選所得的細胞純度高、回收率高、且操作環(huán)境為全封閉型，不易被污染。但是，該方法所需設(shè)備比較昂貴，耗時，且需要高水平的技術(shù)支持以及專業(yè)的操作人員；且該方法在一段時間內(nèi)只能分選一個細胞樣品，若試驗需要從不同的樣品中分選目的細胞時這種方法不可行；同時，由于FACS對細胞刺激較大，因此對分選出的細胞活性有較大影響。

   磁性細胞分選（MACS）是20世紀70年代發(fā)展起來的，是用結(jié)合有抗體的免疫磁珠與樣品細胞進行孵育，表達有相應(yīng)抗原的細胞就會特異性的結(jié)合在包被有抗體的免疫磁性微粒上，當(dāng)體系緩慢的經(jīng)過磁場時，帶有磁珠的細胞就會滯留在磁鐵上，而非目的細胞由于未結(jié)合磁珠仍存在與混合細胞懸液中，從而達到分離純化細胞的目的。MACS法是一種相對高效簡便的細胞分選方法，所需設(shè)備簡單，只需一塊專用磁鐵即可進行分選，操作較為簡單，對操作人員的技術(shù)要求也不高，一般實驗室都可進行磁性分選。磁性分選只是讓細胞處于一個低磁場中，基本可以忽略對細胞的影響，分離得到的細胞具有較高的復(fù)蘇率及細胞活性，對于下游應(yīng)用影響較小，在保持細胞活性方面優(yōu)于流式分選。磁性分選因其高靈敏度、高純度、易操作、對目的細胞刺激較小等特性成為了細胞分選的方法，具有潛在的應(yīng)用前景。

二    免疫磁性細胞分選

2.1 原理

磁性細胞分選是基于免疫學(xué)中抗原抗體之間特異性結(jié)合的原理進行的。以磁性微粒作為載體，對其進行抗體或親和配體包被，形成免疫磁性復(fù)合微粒，當(dāng)其與混合細胞孵育后，磁性微粒表面抗體會與細胞表面的抗原決定簇發(fā)生抗原抗體的特異性反應(yīng)，使得細胞被磁性復(fù)合微粒標(biāo)記。在外加磁場的作用下，抗體與磁珠相連的細胞會因磁珠的磁性而滯留在磁場中，而不表達此抗原的細胞因不能與磁珠表面的特異性抗體結(jié)合而沒有磁性，不能夠在磁場中滯留，從而使目的細胞與非目的細胞分開，得到較高純度的目的細胞。

圖1 免疫磁性細胞分選原理示意圖

2.2免疫磁性細胞分選系統(tǒng)的分類

根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，可以將免疫磁性細胞分選系統(tǒng)分為不同種類。

2.2.1 依據(jù)所標(biāo)記細胞的不同分類

根據(jù)分選過程中所標(biāo)記細胞類型的不同將免疫磁性細胞分選系統(tǒng)分為陽性分選、陰性分選和復(fù)合分選。

陽性分選（IPHASE人CD3+T細胞陽性分選試劑盒），即將目的細胞亞群直接從細胞懸液中分離出來。通過磁珠包被目的細胞的特異性抗體與混合細胞懸液孵育，在抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，通過磁分離方式，將目的細胞分離出來。

陰性分選，即從多細胞懸液中分離去除非目的細胞而得到目的細胞的一種方法。此方法的優(yōu)點在于整個分選過程中目的細胞都未與磁珠（IPHASE SA磁珠）結(jié)合。由于抗原抗體的結(jié)合可能會引起細胞膜表面的信號傳遞，因此，此法具有較大的優(yōu)勢。但同時此方法也有不足之處，當(dāng)靶細胞的細胞數(shù)所占細胞比例較小時，分選過程中存在的非特異性吸附會直接導(dǎo)致目的細胞的損失，此外，非目的細胞未被充分去除等，都會使得細胞的分選效率和分選純度較低。

復(fù)合分選是指聯(lián)合使用兩種以上的分選策略進行分選，這種方法主要用于細胞亞群的分選或者想要分離得到高純度的稀有細胞。

2.2.2依據(jù)分選方法的不同分類

    根據(jù)分選方法的不同可以將免疫磁性細胞分選分為直接分選法和間接分選法。

直接分選法是指將抗體或者親和配體直接包被在磁性顆粒上，形成免疫磁性復(fù)合微粒，將其與多細胞懸液混合孵育之后，目的細胞會特異性的結(jié)合在免疫磁珠上，在外加磁場作用下，帶有磁珠的目的細胞會滯留在磁場中，而非目的細胞則會被去除。

間接分選法分選細胞引入了二抗，即將目的細胞首先與對應(yīng)的一抗孵育，激活細胞，之后清洗出去未結(jié)合的一抗，然后加入預(yù)先包被有二抗的磁性顆粒與活化后的細胞孵育，一抗與二抗之間的相互作用會導(dǎo)致磁粒結(jié)合在目的細胞上，同樣在磁場作用下滯留目的細胞，達到分選的目的。

2.3免疫磁性細胞分選系統(tǒng)的組成

免疫磁性細胞分選系統(tǒng)主要有磁性微粒、待標(biāo)記抗體、磁性分離器（磁力架）、緩沖體系等組成。其中，磁性微粒的選擇是分選成敗的關(guān)鍵。

磁性微粒是指具有磁性或超順磁性的粒子、磁性膠質(zhì)體、磁性脂質(zhì)體等。較為常見的磁性物質(zhì)為Fe3O4或γ-Fe2O3磁性微粒；也有二氧化鉻和鐵素體的磁性微粒。應(yīng)用于細胞分選的磁粒（IPHASE SA磁珠）具有非常嚴格的標(biāo)準(zhǔn)，其化學(xué)性質(zhì)必須穩(wěn)定，分散性好，在細胞懸液中不團聚，去掉外加磁場后沒有磁滯現(xiàn)象，且不能吸附非特異性細胞，磁粒儲存過程中親和配體不能掉落，分選過程中可迅速、*的被磁性分離，并可最大限度地減少細胞的吞噬作用。

磁性微粒的粒徑大小對于細胞分選具有很關(guān)鍵的作用，因為粒徑直接決定了磁粒的物理性質(zhì)與可操作性。粒徑較大的磁粒（>1μm）和粒徑較小的磁粒（50~200nm）在細胞分選中都有廣泛的應(yīng)用。在某些情況下，不同的實驗要求需要使用不同特性的磁粒。磁粒粒徑的大小與其標(biāo)記細胞的能力有很大關(guān)系，粒徑大的磁?？梢载撦d更多的標(biāo)記細胞接受部位。并且,細胞分選過程中，標(biāo)記了較大磁粒的細胞，更容易被磁性分離器吸附，對磁性分離器的要求較低，簡單、便宜、磁場強度較低的的磁分離器就可以滿足要求。標(biāo)記物或小分子標(biāo)記物標(biāo)記的粒徑小的磁粒，卻需要昂貴高強度的磁性分離器才能成功分選靶細胞。

2.4免疫磁性細胞分選的過程

磁性細胞分選過程分為磁性標(biāo)記及磁性分離兩個過程。從復(fù)雜樣品中分選靶細胞的流程大致分為三個步驟：

第一步，磁性標(biāo)記物與含有靶細胞的細胞懸液混合孵育。孵育過程中，靶細胞與標(biāo)記物相互作用，通過磁性分離把磁性標(biāo)記物-靶細胞偶聯(lián)產(chǎn)物與其它細胞分離。

第二步，清洗磁性標(biāo)記物-靶細胞復(fù)合物，去除雜質(zhì)。在這個過程中，可直接將磁性復(fù)合物-靶細胞復(fù)合物用來進行細胞培養(yǎng)，也可以裂解細胞，通過色譜分析、電泳或等方法分析細胞內(nèi)容物。

第三步，磁性標(biāo)記物與靶細胞的分離、移除。將磁性標(biāo)記物與靶細胞分開，通過磁性分離去除磁性標(biāo)記物，釋放靶細胞，以便后續(xù)實驗的進行。

2.5免疫磁性細胞分選應(yīng)用

作為細胞生物學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)，細胞分選技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。隨著細胞分選技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫磁性細胞分選技術(shù)已越來越受到研究者的的認可，目前已有許多商業(yè)化的試劑盒和分選磁珠（IPHASE SA磁珠）應(yīng)用于細胞亞群的分選。最常見的為從人的外周血中分離細胞亞群，如B淋巴細胞、T淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、自然殺傷細胞等。

2.6免疫磁性細胞分選效果的評價

細胞分選效果的評價指標(biāo)主要包括分選純度和分選得率。

分選純度是指被分選出所有細胞中目的細胞所占的百分比。

分選得率是指被分選出來的細胞數(shù)與原混合細胞懸液中該種目的細胞數(shù)的百分比。

三    人CD3+T淋巴細胞免疫磁性細胞分選

3.1 CD3+T淋巴細胞概述

免疫細胞（immune cell）是白細胞的俗稱，包括淋巴細胞和各種吞噬細胞等，也特指能識別抗原、產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的淋巴細胞等，淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的基本成分。

淋巴細胞包括T淋巴細胞（CD3+）、B淋巴細胞（CD3-CD19+）、NK細胞（CD3-CD16+CD56+），其中T淋巴細胞是淋巴細胞的主要組成。

T淋巴細胞是胸腺依賴淋巴細胞（thymus dependent lymphocyte），簡稱T細胞。CD3+T淋巴細胞代表全T淋巴細胞，包括輔助/誘導(dǎo)T淋巴細胞（CD3+CD4+）、抑制/細胞毒T淋巴細胞（CD3+CD8+）、CD4+T細胞純真亞群（CD4+CD45RA+/ CD4+CD45RA+62L+）和記憶亞群（CD4+CD45RA-/ CD4+CD45RO+）、功能亞群（CD28+）、激活亞群（CD38+、HLA-DR+）、凋亡亞群（CD95+）等。

3.2人CD3+T淋巴細胞分選試劑盒簡介

IPHASE/匯智和源順應(yīng)市場需求，推出了可用于人CD3+T淋巴細胞分選的試劑盒，助力于生命科學(xué)的研究。根據(jù)分選樣品的不同，分為適用于人PBMC樣品分選和適用于人全血樣品分選的兩種試劑盒。試劑盒操作簡單便捷，各成分對細胞無毒性，且可實現(xiàn)高純度細胞分離的目的，為下游實驗提供便捷。

3.3 試劑盒特點

?便捷性 只需一步操作，即可實現(xiàn)高純度細胞分選。

?高效性 分選得到目的細胞最短只需15min。

?高純度 細胞分選純度可達95%以上。

?高活性 細胞分選后目的細胞存活率高。

圖1

圖1為使用人CD3+T細胞陽性分選試劑盒分離人全血后，使用克隆號為HIT3a的人CD3-FITC流式抗體進行染色后，經(jīng)流式細胞儀分析結(jié)果。左圖為未經(jīng)分選流式圖；右圖為經(jīng)陽性分選后的流式圖。

3.4試劑盒原理

采用免疫磁珠陽性分選的方法，利用偶聯(lián)于磁性微粒上人CD3單克隆抗體的高度特異性，使磁珠特異性結(jié)合PBMC（人外周血單個核細胞或臍帶血單個核細胞）中的CD3+ T細胞，通過外加磁場的作用，使得CD3+ T細胞得以滯留在磁場中而被分離出來。

3.5試劑盒組成

3.6 試劑盒分選流程

圖2 試劑盒分選流程

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